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肌旋毛虫标本5种染色方法的比较

2019-10-23 18:20
旋毛虫病是一种常见的人畜共患病,人与动物可以通过食入含有活的幼虫囊包肉类或肉类制品而感 染此病。因此,在寄生虫教学中,让学生直观、准 确地认识旋毛虫囊包具有重要意义。将寄生虫制成 永久玻片标本,可延长其保存时间,且可观察其结构, 在寄生虫学的教学、科研及寄生虫病的诊断和防治工 作中发挥着十分重要的作用。

1 材料

旋毛虫阳性小鼠肌肉,兰州兽医研究所馈赠; 健 康小白鼠 4 只,雌雄各半,内蒙古农业大学兽医学院 基础兽医学药理实验室提供。 卡红( 批号为 243590) ,购自 B. D. H. Laboratory Chemicals Group; 硼砂( 批号为 20140310) ,购自天津 市北联精细化学品开发有限公司; 苏木素( 批号为 810520) ,购自上海化学试剂厂; 孔雀绿石( 批号为 58083) 、丁香油( 批号为 030710) ,均购自北京市化学 试剂厂; 无水乙醇( 批号为 20170419) ,购自成都市科 隆化学有限公司; 甘油( 批号为 20150927) ,购自天津 市富宇精细化工有限公司; 冰 醋 酸 ( 批 号 为 20160503) 、二甲苯( 批号为 20170915) ,均购自天津 市风船化学试剂科技有限公司; 加拿大树胶( 批号为 20170222) ,购自国药集团化学试剂有限公司; 磁力 搅拌器( 型号为 85-2B) ,购自常州人和仪器厂; 万分 之一天平( 型号为 NBL254I) ,购自德国赛多利斯公 司; 显微镜( 型号为 STEMI508) ,购自德国 ZSISS 公 司; 恒温培养箱( 型号为 DHP -9270) ,购自上海一恒科学仪器有限公司。

2 方法

2. 1 肌旋毛虫感染小鼠的制备

将小鼠断食 2 d 后分别饲喂两块米粒大小旋毛 虫阳性小鼠肌肉。在感染后第 30 天时将小鼠断髓处 死,取其全身各处肌肉进行压片,在显微镜下观察幼 虫的囊包和囊内虫体的形态。

2. 2 主要试剂的配制

1%酸乙醇: 70%乙醇 99 mL,加浓盐酸 1 mL 即配 成 1%酸乙醇。 固定液: 甲醛 180 mL、95%乙醇 600 mL、冰醋酸 30 mL、纯化水 1 200 mL,混合均匀。 45%醋酸卡红染液: 将 45 mL 冰醋酸和 55 mL 纯 化水混匀,再将 5 g 卡红加入其中,经过加热煮沸后 过滤,密封保存。使用时将 1 份所配制的原液稀 释 100 倍,备用。 硼砂 卡 红 染 液: 将纯化水加热至 80 ℃,量 取 100 mL加入 4 g 硼砂搅拌至溶解,配成 4%硼砂水溶 液。在硼砂水溶液中加入卡红 1 g,煮沸使之溶解,然 后加入 70%乙醇 100 mL,混匀后过滤,备用。 4%孔雀绿染液: 将 4 g 孔雀绿石加入 100 mL 水 溶液中,搅拌至完全溶解,配成 4%孔雀绿水溶液,避 光,备用。 苏木素染液: 称取苏木素 1 g,将其加入到 99 mL 的无水乙醇中溶解; 然后将 60 g 明矾放入 100 mL 纯 化水中溶解,再混入 100 mL 甘油微热。将两种溶液 混合后加入 10 mL 冰醋酸。然后将其转移到干净的烧瓶中并用棉花轻轻塞住瓶口,放在空气和阳光中暴 露 2 ~ 3 周,每天振荡溶液。在这个过程中,部分苏木 素会被氧化变为深红色,把溶液转移到一个密封封口 的试剂瓶中保存,备用。

2. 3 染色方法

2. 3. 1 45%醋酸卡红原液稀释

100 倍染色法 1) 固 定: 将显微镜下观察到的含有肌旋毛虫的小鼠肌肉用 两个载玻片压片,橡皮圈两端捆扎,放到配制好的固 定液中固定 24 h。然后将固定液中浸泡的标本的一 侧橡胶圈解开,使固定液与标本充分混合,并将其转 移到新的固定液中继续浸泡 24 h。 2) 染色: 从固定液中取出标本并打开载玻片,用 手术刀片和镊子将标本小心刮取下来,在清水中清洗 5 min,然后放到稀释后的染液内染色 20 h。 3) 分色: 将标本从染液中取出,用纯化水冲洗至 不脱色为止( 约 5 min) ,然后在 1% 酸乙醇中分色 1 min。 4) 脱水: 将分色后的标本依次放入 80%、90%、 95%、100%乙醇中各脱水 30 min。 5) 透明: 将标本放入无水乙醇和丁香油( 比例为 1 ∶ 1) 混合液中透明 30 min,然后用纯丁香油浸泡 30 min。 6) 封片: 用镊子轻轻夹取肌肉标本放在洁净载 玻片上,用镊子轻轻按压使肌肉标本平整,然后在肌 肉标本处滴适量中性树胶,加盖玻片封片,平放在标 本盒内,然后将标本盒放入 37 ℃温箱中 24 h,排净树 胶中的气泡,最后室温阴干。

2. 3. 2 硼砂卡红染色法

1) 固定: 方法同 2. 3. 1。 2) 染色: 从固定液中取出标本并打开载玻片,用 手术刀片和镊子将标本小心刮取下来,在清水中清洗 5 min,放入染液内染色 12 h。 分色、脱水、透明、封片同 2. 3. 1。

2. 3. 3 4%孔雀绿染色法

1) 固定: 方法同 2. 3. 1。 2) 染色: 从固定液中取出标本并打开载玻片,用 手术刀片和镊子将标本小心刮取下来,在清水中清洗 5 min,放入染液内染色 24 h。 3) 分色: 方法同 2. 3. 1。 4) 脱水: 将肌肉标本依次放入 80%、90%、95%、 100%乙醇中各 1 min。 5) 透明: 将标本放入无水乙醇和丁香油( 比例为 1 ∶1) 混合液中透明 5 min,再转入纯丁香油中浸泡 30 s。 6) 封片: 方法同 2. 3. 1。

2. 3. 4 苏木素染色法

1) 固定: 方法同 2. 3. 1。 2) 染色: 苏木素染液在染色前需要用 10 ~ 15 倍 水稀释。从固定剂中取出标本并打开载玻片,用手术 刀片和镊子小心取出标本,并放入清水中 5 min,然后 把标本放入染液内染色 10 h。 3) 分色和脱水: 染色后的标本分别移入 30%、40%、50%、60%、70%乙醇中各脱水 30 min,然后在 1%酸乙醇中褪色,当颜色适宜时,取出并放入 70%乙 醇中洗 3 ~ 5 次,每次 2 ~ 3 min。之后再移入 80%、 90%、95%、100%乙醇中脱水各 30 min。 4) 透明: 将标本放入无水乙醇和丁香油( 比例为 1 ∶ 1) 混合液中透明 30 min,然后用纯丁香油浸泡 30 min。 5) 封片: 方法同 2. 3. 1。 2. 3. 5 不染色 1) 固定方法同 2. 3. 1。 2) 脱水: 从固定剂中取出标本并打开载玻片,用手 术刀片和镊子小心取出标本,放入清水中 5 min,肌肉 标本在 80%、90%、95%、100%乙醇中各脱水 1 min。 3) 透明: 放入无水乙醇和丁香油( 比例为 1 ∶ 1) 混合液中透明 30 min,然后用纯丁香油浸泡 30 min。 4) 封片: 方法同 2. 3. 1。

3 结果与分析

45%醋酸卡红原液稀释 100 倍染色法制得的标 本在显微镜下观察发现,其呈淡粉红色,囊包壁颜色 较深,囊内幼虫呈淡粉色,囊包与肌肉组织界限分明, 标本染色不均匀并且接近于不染色。

4 讨论

肌旋毛虫染色标本的制作方法有很多种,标本的 制作效果与溶液的浓度、种类,染色过程中各个步骤 时间的控制,所采用染料在溶液中的含量及其种类均 有很大关系。本次试验在染色时仅采用了所查 找资料中各方法的最适染色浓度进行染色。

5 结论

通过对比观察 5 种染色方法得到的玻片标本发 现,用苏木素染色法和 4%孔雀绿染色法染色的标本 染色均匀,囊包与肌肉界限明显,囊内虫体清晰。其中 4%孔雀绿染液配制简单,染色后的脱水时间短,便于 快速制片。因此,肌旋毛虫染色标本的制作首先推荐 使用 4%孔雀绿染色法,其次推荐使用苏木素染色法。

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